洁净室用消毒剂（PROCESS VESPHENE II）验证

摘要 目的：选用的消毒剂（PROCESS VESPHENE II）能符合药厂无菌室使用要求而进行该消毒剂的验证。结果 PROCESS VESPHENE II经实验室确认和无菌室使用后环境监测结果符合公司标准。

　　关键词：PROCESS VESPHENE II 消毒剂 验证
　　
　　制药企业洁净室通常都使用一种以上的消毒剂进行洁净室消毒。一般在选择一个消毒剂时，应考虑消毒剂是否能广谱地杀灭微生物；对人体无害；无腐蚀性，对设备无污染；具有洗涤剂作用；具有稳定性；作用迅速；不因有机物的存在而失去活性；产生所期望的后效作用；廉价。

　　我公司在进行消毒剂供应商调查过程中发现，奥星公司代理的美国Steris公司生产的消毒剂产品包装轻巧（单剂量包装），经γ射线辐射灭菌，适合无菌室清洁消毒使用 ，结合公司实情，选择了碱性苯酚类清洁消毒剂（PROCESS VESPHENE II）产品进行验证。

　　1.实验室确认

　　1.1目的

　　消毒剂验证首先是在实验室进行对代表细菌的有效杀灭情况进行确认，符合要求后用于洁净区域清洁，作环境验证。本方法通过特定的微生物与待确认的消毒剂（使用浓度下）接触后，对微生物进行培养、计数，考察消毒剂的效果。

　　1.2实验用具

　　1.2.1 指示菌种
　　金黄色葡萄球菌
　　白色念珠球菌

　　1.2.2 SCD预制培养基平板 用于细菌培养计数 
　　按照SCD干粉培养基配制说明书制备，保存。

　　1.2.3 TSB液体培养基 用于细菌增殖培养
　　按照TSB干粉培养基配制说明书制备，保存。

　　1.2.4 无菌具塞试验管（15ml）

　　1.2.5 MILIPORE微生物限度试验过滤装置

　　1.2.6 无菌纯化水
　　MILI-Q超纯水于121℃，15分钟灭菌后冷却备用。

　　1.2.7 无菌生理盐水
　　0.9g氯化钠溶于100ml的MILI-Q超纯水，于121℃，15分钟灭菌后冷却备用。

　　1.3 待验证消毒剂（ PROCESS VESPHENE II）

　　1.3.1待验证消毒剂的配制
　　PROCESS VESPHENE II（1：128稀释）：吸取该消毒剂2毫升，用无菌纯化水稀释至256毫升。然后分注10ml于无菌具塞试验管，共分注15管备用。

　　1.3.2 指示菌增殖培养物
　　取金黄色葡萄球菌、白色念珠球菌分别接种于TSB液体培养基，于23.5℃培养24-48小时即得，培养后微生物浓度应不少于106个/ml。

　　1.3.3 验证用消毒剂的配制和准备工作
　　按使用浓度稀释消毒剂至500ml。
　　取10ml稀释后的消毒剂分注于无菌具塞试验管。每种试验用微生物试验管分"5分钟组"、"10分钟组"和"15分钟组"共3组，每组2支。

　　1.4 试验步骤（接种金黄色葡萄球菌）

　　1.4.1微生物的接种
　　取金黄色葡萄球菌增殖培养物0.2ml，分别接种于上述3组共6支盛有待验证消毒剂的无菌具塞培养管，轻轻摇动，混合均匀，并立即开始计时。 

　　1.4.2 过滤
　　5分钟后取上述"5分钟组"的接种细菌的消毒液，倾入过滤杯滤过；然后各用无菌生理盐水50ml清洗滤膜，滤过，重复3次。同组另一支同上操作。

　　1.4.3 "10分钟组"和"15分钟组"的操作
　　消毒剂与细菌培养物悬浮液混合10分钟后、15分钟后，重复4.2至4.3的操作。

　　1.4.4 培养和计数
　　取下滤膜放入SCD预制培养基平板，含菌膜面向上。
　　于32.5℃的恒温箱内培养7天。
　　7天后在明亮处，对平板上的菌落数进行计数。

　　1.4.5 阳性对照
　　取金黄色葡萄球菌增殖培养物0.2ml于滤杯内，加无菌纯化水进行梯度稀释至浓度为10~100cfu/ml，取稀释液体1m于SCD预制培养基平板后，按4.4培养和计数

　　1.5 接种白色念珠球菌的操作重复步骤4的操作。

　　1.6 试验结果
　　试验结果见下表1。 

　　表1：PROCESS VESPHENE II消毒剂杀菌效果 　　　　　　单位：cfu/ml

时间	菌种	PROCESS VESPHENE Ⅱ
5分钟	金黄色葡萄球菌	0	0
	白色念珠球菌	0	0
10分钟	金黄色葡萄球菌	0	0
	白色念珠球菌	0	0
15分钟	金黄色葡萄球菌	0	0
	白色念珠球菌	0	0
阳性对照	金黄色葡萄球菌	培养24小时后即为TNTC
	白色念珠球菌	培养24小时后即为TNTC

　　*备注："TNTC"为细菌太多而无法计数的英文缩写。

　　1.7 结论
　　消毒剂PROCESS VESPHENE II按照其产品标签的标示稀释浓度进行配置后，在5分钟时便能有效杀灭105金黄色葡萄球菌和白色念珠球菌。

　　2 洁净室使用后的环境验证

　　2.1洁净室空气净化系统恢复
　　确认空气洁净级别不同的相邻房间之间的静压差符合GMP对洁净室管理的要求。

　　2.2洁净室清洁
　　生产车间岗位操作人员，使用灭菌注射用水，按PROCESS VESPHENE II标签上标示使用浓度稀释后，按照SOP规定的洁净室清洁消毒方法，分别擦拭1万级（包括万级内的局部100级）、10万级房间地板、工作台面和墙面等区域。

　　2.3清洁后第2日，由品管人员到车间洁净区域对环境采样，采样项目有表面菌、沉降菌和浮游菌数，连续隔日测定，共测定3次。

　　2.4测定结果
　　各洁净区域测定结果见下列表（2、3、4）。
　　表2.环境监测表面附着菌测定结果 　　　　　　　　　　　　单位：cfu/皿 

区域	洁净级别	平均菌数
		第一次	第二次	第三次
称量区	100	0	0	0
	10，000	3.4	2.5	8.5
	100，000	5	6	10.5
配液区	10，000	0.5	1	0.3
	100，000	7	2	7
灌封区	100	0.4	0.6	0.2
	10，000	2	12.5	1
	100，000	0	5	4
洗净区	100，000	15.5	9	19.5

　　表3.环境监测沉降菌测定结果 　　　　　　　　　　　　　　单位：cfu/皿 

区域	洁净级别	平均菌数
		第一次	第二次	第三次
称量区	100	0	0	0.2
	10，000	０	0	1.4
	100，000	１	0	4.5
配液区	10，000	０	0	0
	100，000	０	0	0
灌封区	100	０	0.2	0
	10，000	０.9	0.1	0
	100，000	1	4	0
洗净区	100，000	0	1	0.5

　　表4.证环境监测浮游菌测定结果 　　　　　　　　　　单位：cfu/m3

区域	洁净级别	平均菌数
		第一次	第二次	第三次
称量区	100	0	1	4
	10，000	０	6	0
	100，000	50	2	70
配液区	10，000	2	2	2
	100，000	30	2	0
灌封区	100	０	0	0
	10，000	4	4	4
	100，000	80	30	0
洗净区	100，000	20	80	30

　　注：采样量为100级1000升，1万级500升，10万级100升。
　　浮游菌浓度计算公式：（菌落数×1000）/ 采样量
　　以上表2、3、4的环境测定结果表明，所监测的洁净区的微生物均在公司环境质量控制范围内，各洁净区符合各自的洁净级别要求。

　　3 结论
　　消毒剂PROCESS VESPHENE II的验证结果表明，该消毒剂适用于洁净室常规的清洁消毒，并能用于洁净室的日常洁净维护。
　　参考文献
　　1. James D. Wilson, Abbott Laboratories, North Chicago, Illinois. 消毒验证（Validation of Sanitization）P273～290；无菌制药工艺的验证；上海科学普及出版社