细菌内毒素的研究进展

细菌内毒素的研究进展
目    录
 
中文摘要及关键词 （1）
英文摘要及关键词 （2）
前言 （3）
1 细菌内毒素的化学组成 （3）
2 细菌内毒素的生物学活性 （4）
3 内毒素的病理生理作用机制 （5）
4 细菌内毒素受体的研究进展 （5）
4.1 CD14 （6）
4.2 TOLL样受体 （7）
4.3 清道夫受体 （8）
4.4 LBP （9）
5 细菌内毒素的检测方法 （10）
5.1 鲎氏实验 （10）
5.1.1 半定量测定-凝胶法 （10）
5.1.2 定量测定 （10）
5.1.2.1 浊度法(比浊法) （10）
5.1.2.2 显色基质法(比色法) （11）
5.1.2.3 酶联免疫吸附测定法(ELISA) （11）
5.2 免疫学方法 （11）
5.3 生物学方法 （11）
5.4 化学发光法 （11）
5.5 流式细胞术 （11）
6 内毒素的制备 （11）
7 内毒素抗体的保护作用 （12）
参考文献 （13）
致谢 （14）
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
摘　　要
 
本文从细菌内毒素的化学组成、生物学活性、致病机理、内毒素的制备与检测及内毒素受体的作用等方面，对细菌内毒素的研究进展进行了综述，并对本领域的研究方向及前景进行了讨论。
 
关键词: 内毒素；生物学活性；致病机理；检测方法
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Abstract
 
This article from the bacterial endotoxin in chemical composition, biological activity, the pathogenic mechanism, within the endotoxin and the preparation and testing, endotoxin receptor in the role of bacterial endotoxins of progress were reviewed, and this field of study direction and prospects were discussed．
 
Key words：endotoxin; biological activity; pathogenic mechanism; examination method
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
前　　言
 
内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁的脂多糖(LPS)成分， 是与细菌细胞壁牢固结合的一种大分子结构物质，只有在细菌死亡时、繁殖时或人工破坏时，才释放到细胞外，发挥其各种效应，细菌内毒素首先由Boivin等［1］1933年用三氯醋酸自鼠伤寒杆菌中提出，当时因其一般蛋白质反应呈阴性，而称之为脂多糖（LPS）。随后其他学者用不同方法从各种革兰氏阴性菌中提出与LPS相似的物质，该物质具有多种毒性反应，为区别于外毒素，而称之为内毒素。另一些学者则根据其具有O型菌的特异抗原性，命名为O抗原或菌体抗原，以区别于H抗原或鞭毛抗原。脂多糖的类脂A是LPS的“毒力中心”。正常机体肠腔内含有大量细菌及内毒素，有报道称正常肠黏膜可允许少量内毒素进入门脉，而少量内毒素对促使肝脏网状内皮系统处于激活状态有一定意义。当机体受到创伤(包括手术)、烧伤、感染、和接受长期传统的肠外营养时，肠黏膜有可能发生通透性增高，导致细菌和内毒素移位。在某些情况下，细菌感染可能被控制，但内毒素仍可通过“漏”的肠黏膜，引起炎症的激活及细胞介质的释放，导致全身炎症反应综合征(SIRS)、多器官功能不全综合征(MODS)甚至多脏器功能衰竭(MOF)［2］。因此认为，革兰氏阴性菌释放的内毒素是造成革兰氏阴性菌感染的临床和实验室表现的原因。且革兰氏阴性菌血培养需要花费数天时间，因此细菌内毒素的测定对早期诊断病情比细菌移位更有意义。有研究结果表明，内毒素血症是临床上有用指标，预测革兰氏阴性菌败血症的阳性预测值为48%，而没有内毒素血症就可基本排除发生血症的可能，阴性预测值为99%［3］。
 
 
1　内毒素的化学组成
细菌内毒素是由LPS、蛋白质和磷脂组成的复合物，分子量约1×10～20×10道尔顿。内毒素与菌体细胞壁密切相连，其活性成份是LPS，而蛋白质和磷脂与内毒素的活性无关。LPS为革兰氏阴性菌外膜中的脂多糖成分。它是由三部分组成：(1)O-特异性侧链；(2)核心多糖；(3)类脂A。O-特异性侧链由20-40个重复单位组成，每个重复单位由3-7个糖分子组成。它是细菌表面的主要抗原，决定型的特异性，核心多糖可以分为连接O-特异性侧链的外核部分和连接类脂A的内核分。核心多糖相对稳定，同一菌属结构相同。内核部分含有庚糖和2-酮基-3-脱氧辛酸(KDO)两种特殊的糖类分子。它们在LPS结构中起着连结多糖与类脂的作用。其中类脂A是LPS活性不可缺少的部分，可视作LPS的“生物活性中心”，是抗原活性部位，保存着LPS的各种生物学活性[4]。在类脂A成分中，脂肪酸约占70%～80%，各种细菌类脂A的脂肪酸性质和排列不同。类脂A的生物学活性主要在于其以酯键相连的脂肪酸，若其被水解，类脂A或LPS即失去活性。类脂A具有免疫原性，注入动物全内可以产生相应抗体。基于对类脂A整个成份、结构、功能有了详细了解，80年代前后报道了合成类脂A，并将合成类脂A与天然类脂A的生物学活性作了比较，表明合成类脂A具有天然类脂A的某些活性，只是活力比天然类脂A低。
2　内毒素的生物学活性
细菌内毒素的生物学活性多种多样，尤其在机体内的表现，错综复杂，各单项活性之间常相互联系，相互促进或制约。在体内或特定的体外条件下，所表现的活性，有时为数种活性综合作用的结果。在不同的实验条件下，包括不同的机体、不同的内毒素制品、不同的剂量、不同的测试方法等，所得到的结果也不一致。现将其生物学活性总结如下：第一，内毒素具有致热性，可使人和动物发热，体温升高；第二，给动物注射内毒素，早期白细胞数量减少，后期白细胞数量明显增加；第三，内毒素可引起血小板粘附、聚集、触发凝血系统，导致弥漫性血管内凝血（DIC）。具有激活凝血系统作用；第四，内毒素既能激活补体活化的经典途径，也能活化旁路途径。活化过程中产生的C3a、C5a具有过敏性毒素作用；第五，内毒素可导致动物发生什瓦茨曼(shwartzman)现象；第六，内毒素进入动物体内可导致心肌损害、肺损伤、肝衰竭、肾衰竭、胃肠道损伤等多器官功能障碍；第七，内毒素具有较强的抗原性，能刺激机体产生相应的抗体，同时也能增强机体非特导性免疫力，即诱导抗感染的特异性抵抗力；第八，内毒素具有免疫佐剂活性。内毒素作用于靶细胞产生细胞因子TNF、IL-1、IL-6等，可被作为复合免疫佐剂；第九，内毒素注射入实验动物，常可导致动物死亡。此外，内毒素还能导致怀孕动物流产、早产或死胎；抑制红细胞生成；具有致敏和抗敏作用；刺激淋巴细胞有丝分裂；鲎细胞溶解物（鲎试剂）的凝集；肿瘤细胞坏死作用等。
3  内毒素的病理生理作用机制
内毒素(endotoxin，ET)主要通过刺激单核细胞和巨噬细胞，使其产生白细胞介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素(IFN)、巨噬细胞炎症蛋白-1(MIP-
1)、白细胞致热源(LP)和睫状体促神经因子(CNTF)等细胞因子而致病。LPS所引起炎症反应的病理作用分系统和细胞两个方面。在系统方面，LPS导致凝血系统活化，纤维蛋白形成增加，纤维蛋白降解减少。凝血系统出现的这些改变造成临床患者发生弥漫性血管内凝血(DIC)。在细胞方面，LPS可刺激一些效应细胞产生活性因子，尤其是LPS刺激单核细胞巨细胞和内皮细胞产生多种促炎症细胞因子，如N17-n、11-IB。受LPS刺激细胞产生的细胞因子，迅速活化不同组织器官的细胞，导致机体代谢、激素水平和神经内分泌的改变，进而造成细胞功能的异常和不同器官的进行性衰竭。研究证明，内毒素所引起的各种生物学效应是通过与靶细胞作用而诱导这些细胞产生一系列炎症介质和细胞因子表现出来的，并非内毒素本身的效应。这些靶细胞包括单核-巨噬细胞、B淋巴细胞、粒细胞、血小板、成纤维细胞和内皮细胞等。内毒素诱导产生的炎症介质和细胞因子有C3a、C5a、内啡呔、凝血因子、PAF、TNF、IL-1、IL-6、IL-8、IFN等。LPS是目前所知诱导IL-1和TNF 最重要的因素［5］。内毒素诱导细胞因子的合成与分泌。已经证明动物细胞上有类脂A受体的存在，LPS与靶细胞的结合依赖于靶细胞的LPS结合蛋白(LBP)和CD14。LPS和LBP形成LPS-LBP复合物后，再与CD14结合，诱导胞膜及胞浆内蛋白磷酸化，然后启动细胞因子基因表达，产生细胞因子。过敏性毒素内毒素在激活补体活化过程中产生过敏性毒素C3a 、C5a，二者均可使肥大细胞或嗜碱性细胞产生组织胺，引起血管扩张，增加毛细血管的通透性，使平滑肌收缩和支气管痉挛等。此外，C5a还可诱导TNF、IL-1等的分泌，参与炎症反应。内毒素可诱导中性粒细胞、嗜碱性细胞、血小板、上皮细胞等分泌PAF。PAF能引起了血小板聚集释放活性物质，使平滑肌的收缩和血管通透性增高。血小板聚
集，触发凝血系统，引起弥漫性血管内凝血。血小板聚集或参与形成的微血栓栓塞于各脏器，是各脏器功能衰竭的重要原因。细胞因子TNF和IL-1是内毒素刺激单核-巨噬细胞等所产生的两种主要细胞因子，它们能作用于各类细胞增强与促进局部和全身炎症过程有关的基因表达以及增强内皮细胞粘附因子的表达。TNF和IL-1作用相似，均为内源性致热原，可导致发热[6]，促进白细胞渗出，破坏血凝-抗血凝平衡，抑制抗凝血机制，导致血栓形成等。内毒素诱导靶细胞产生细胞因子，一方面可激活机体局部和整体的免疫系统参与清除细菌感染；另一方面如果细胞感染严重，大量细菌在血中繁殖，使循环血中堆积大量内毒素，产生大量细胞因子，则可能导致内毒素性休克。
4   细菌内毒素受体
近年来有关内毒素受体的研究报道的非常多，已发现了4类分子家族与LPS脂质A部分结合参与炎症信号转导，包括CD14、脂多糖结构蛋白(lipopolysaccharide binding protein，LBP)、Toll样受体(Toll-Like  Receptors，TLRs)、清道夫受体、T和β2白细胞整合素(CD11a/CD18，CD11b/CD18，CD11c/CD18等)。目前有关β2白细胞整合素的文献报道较多，现重点对前四者的研究进展进行阐述。
4.1  CD14（分化抗原14）
CD14是最早确认的LPS受体。1985年有人用单克隆抗体发现了单核细胞表面、髓样细胞(myeloid cell)培养上清液和正常人血浆中一种55ku的蛋白质，后来这种蛋白质在国际白细胞抗原研讨会(international worksphos on leukocyte antigens)上被命名为CD14，成为髓样细胞分化抗原中的一员。动物体内有两种形式的CD14，一种是膜结合形式(mCD14)，主要分布于髓样细胞表面，并作为这类细胞分化的标志，mCD14通过糖基磷脂酰肌醇锚定在细胞膜上[7]，相对分子质量约为5×104～515×104；另一种是可溶性形式(sCD14)，主要存在于血清中，介导非髓样细胞的激活，相对分子质量约为418×104～516×104。sCD14主要来自髓样细胞表面mCD14的脱落，或由髓样细胞合成后分泌[8]。LPS入侵机体后首先由单核细胞对它产生识别与应答作用，产生一系列细胞因子：肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)等。而在这个过程中CD14起主要的介导作用，CD14可以帮助LPS结合于单核细胞，实现机体识别LPS的第一步。研究发现，阻断LPS与CD14的结合可抑制LPS对单核细胞、中性粒细胞的刺激作用。将CD14基因转入大鼠未成熟B细胞后，此细胞对LPS的敏感性提高1000倍。更直接的实验发现，利用125I标记的LPS可以直接结合于细胞表面。利用ELISA法证实了sCD14能够直接与LPS结合。从而可以推断，CD14其生物学功能主要是识别、结合LPS或LPS/LBP复合物，介导LPS所致的细胞反应，在LPS性炎症反应、内毒素休克等病理反应中起着作用。若能够完全封闭CD14的功能，特异性的阻断CD14与LPS及LPS/LBP复合物结合，就能够防止或中止LPS性炎症反应、内毒素休克等病理反应的发生，对于临床治疗内毒素血症、内毒素休克等将会有重要意义[9]。许多资料显示，mCD14是细胞表面被低剂量LPS激发炎症反应的关键受体(大剂量LPS刺激不依赖于mCD14)。LPS可通过3种方式与CD14结合，包括完整细菌细胞壁上的LPS、聚集的LPS分子团以及LPS单体。然而，LPS被CD14识别并不是直接的，它需要脂多糖结合蛋白(LBP)催化。科学家还研究发现sCD14可以介导LPS对缺乏CD14的单核细胞PNH细胞具有刺激作用。由此可见，虽然机体只有少数几种细胞可以表达CD14，但是sCD14可以介导其他CD14阴性细胞(血管内皮细胞、上皮细胞)对LPS产生应答作用，参与LPS在体内的信号转导，激活机体的免疫系统，当前大量的研究都集中在免疫细胞对LPS的信号转导作用，但是对其他非免疫细胞的研究还不够充分，有待更深入的研究。
4.2  Toll样受体(Toll-Like Receptors，TLRs)
近年来信号受体Toll的发现为LPS受体的研究找到了突破点。目前发现的TLR成员有12种，主要分布于一些免疫器官，例如脾脏和胸腺等。参与LPS信号跨膜传递的TLR主要有TLR2、TLR4和TLR5。Toll与其配体Spatzle结合而被激活，可引起胞浆内的转录因子dorsal的抑制因子cactus的降解、分离，从而dorsal被激活而启动机体的免疫防御反应。由于它对于机体免疫系统的重要性，对Toll信号受体的研究有可能明确革兰氏阴性菌感染的机制，从而为此类疾病的治疗带来有效的手段。
由于Toll的LRR区域具有识别蛋白、肽、碳氢化合物等的功能，Toll极有可能是LPS的识别受体，将刺激信号传入胞内。Toll样受体的胞内段含Toll同源结构域(Toll-Homolgy domain，TH do-main)，TH结构域与IL-1R胞浆结构具有高度的同源性，又将TH结构域称为Toll/IL-1R(TIR)同源区，这是TLRs和IL-1R向下游传导信号的核心元件。几乎所有的Toll均参与天然免疫反应，但它们的天然配体还不清楚，目前对TLRs研究得较多的是TLR2和TLR4。尽管革兰氏阴性菌各种成分相差很大，但LPS为革兰氏阴性菌胞壁所共有，它包括相同脂质A和具种间差异的多糖成分，Toll受体仅识别脂质A，这样机体就能识别整个革兰氏阴性菌病原菌，科学家将存在于胞壁为大多数微生物所共有的一类分子称为病原相关分子物质结构(pathogen-associatedmolecular patterns，PAMPs)，Toll受体所识别的结构正是PAMPs。人Toll与果蝇Toll蛋白的同源性以及在免疫防御反应中起重要作用，可以看出Toll受体进化的保守性，它是维持生命不可缺少的成分［10］。
4.3  清道夫受体（SR）
主要分布于巨噬细胞表面，尤其是肝脏的枯否氏细胞上，有SR-A和SR-B两种形式，其中SR-A参与LPS的识别、结合和降解。牛SR是由3个77ku单体糖蛋白组成的三聚体，广泛分布于不同的器官组织，其中巨噬细胞是SR的主要表达场所。最早发现SR的功能是其参与动脉粥样硬化的病理过程，它通过摄取氧化型低密度脂蛋白、促进胆固醇沉积，从而使动脉粥样硬化发生。近年研究发现，巨噬细胞表面SR是参与宿主早期防御的重要受体。SR可与革兰氏阴性菌细胞壁或循环中游离的LPS结合，这种结合并不引起炎症反应，但在清除和灭活LPS过程中发挥重要作用。
LPS与SR结合后有何病理生理作用呢？据报道，用LPS刺激小鼠腹腔巨噬细胞，发现LPS与SR-A结合能阻止一个41ku蛋白的酪氨酸磷酸化，使NO合酶产生降低，从而使NO合成与释放显著减少。从缺乏SR-A的小鼠(SRKO)观察到，SRKO对LPS非常敏感，低剂量LPS可导致大量TNF-α等细胞因子产生，用抗TNF-α抗体可降低动物死亡率。由此可见，SR-A在巨噬细胞上表达可清除LPS，减少炎性因子的释放，保护宿主防御功能。SR还有一种“模式识别”能力，通过其阳离子胶原区与配体的多聚阴离子结合，对不同种类的配体均有高度的亲和力。SR-A主要在巨噬细胞上表达，而肝脏枯否氏细胞占全身巨噬细胞90%以上，因此肝脏是清除代谢产物及毒物的主要器官。在无血浆的情况下用LPS与大鼠枯否氏细胞作用，发现多种多聚阳离子可阻止125I LPS与枯否氏细胞相结合，说明了LPS与枯否氏细胞结合位点是在SR上。流式细胞分析显示，CD14在枯否氏细胞上表达量极低，且LPS诱导的细胞因子反应不依赖于血浆，由此推测存在着一个独立的、不依赖于CD14的SR和(或)TLRs机制来介导枯否氏细胞活化。采用无菌大鼠进一步研究指出，肠道内微生物菌群(特别是革兰氏阴性菌)在调节依赖LPS而不依赖CD14的信息通路中有潜在作用。然而，有人通过基因缺失模型证明，虽然小鼠巨噬细胞SR-A对LPS诱导的脓毒症耐受，但人单核巨噬细胞受到LPS攻击后SR-A表达反而下调，不利于抗炎反应。
4.4  LBP（LPS结构蛋白）
脂多糖结合蛋白(lipopolysaccharide binding protein,LBP)在体内具有LPS增敏作用和中和LPS作用。一方面可促进LPS多聚体解体成单体，加速LPS与CD14的结合，从而增强靶细胞对LPS的敏感性，并经CD14和TLR4进行跨膜信号传递，引起细胞内信号转导及细胞因子的产生，触发一系列炎症反应；另一方面，LBP可催化LPS与脂蛋白结合，加速体内LPS的清除，具有中和LPS作用[11]。机体受LPS刺激后LBP可升高50-100倍。由452个氨基酸组成，其中靠近N末端94位的精氨酸和95位的赖氨酸残基对LPS结合是必需的，替换这两个氨基酸残基则使LPS的结合能力减弱甚至消失，C末端与转移LPS至CD14的功能有关。在细胞对LPS的应答过程中，LBP主要起催化作用。有人发现LBP存在时，0.01-1ng/ml的LPS即可以刺激兔腹腔巨噬细胞产生TNF-α，使LPS的作用增敏1000倍。此外，LBP还可以增强LPS诱导的粘附分子的表达及花生四烯酸代谢，从血浆中去除LBP能明显减少LPS引起的细胞活化。LBP在促使LPS与CD14结合及在LPS发挥生物学活性中起着重要作用，发现从LBP基因敲除(LBP-/-)小鼠分离的血清不能使LPS运送至CD14，提示没有任何其他血清成分可以代替LBP的作用；LBP-/-小鼠静脉注射LPS后，血浆中TNF-α含量明显降低，死亡率下降。更直接的实验发现，只有LBP存在时标记的LPS才能结合单核细胞，同时看到标记的LBP也结合到细胞表面，并且发现结合的半衰期相同，从而认为LBP不仅起到催化LPS与CD14结合的作用，而且与LPS、CD1形成一个复合物，结合到细胞表面，为LPS-LBP-CD14三体的理论奠定了基础。虽然机体最先识别LPS的是LBP/CD14系统，但是它们本身与信号的跨膜转导无关，因为CD14无胞内成分也无与此相连接的酶。因此有学者提出了3种LPS信号跨膜转导的模型。模式Ⅰ为单受体模型，即LPS/LBP与CD14结合后，由另一能够识别mCD14GPI结构的跨膜蛋白将信号转导到细胞内。模式Ⅱ和模式Ⅲ则认为LPS受体是一个多聚体，由配体结合亚单位mCD14和一个附加的跨膜蛋白转导信号。LPS信号转导的跨膜结构成分至今尚未研究清楚。
5  细茵内毒素检测方法
5.1  鲎试验法
1956年，Johns Hop hins大学的动物学家Bang博士发现革兰氏阴性细菌的粗制品能使鲎的血细胞凝聚而死亡。1963～1964年该大学医学院血液室的Levin和Bang合作对细菌引起鲎血凝聚的机制进行了深入的研究，用提纯的内毒素和鲎血细胞溶解物证明了鲎血凝聚机制是一种酶反应。近十余年来，细菌内毒素试验的方法已取得很大进展，目前有凝胶法(Cel-clot-techique)；比浊法(Turbidmeuic assay)；比色法(Colori-metricas-say)和免疫学方法(Immunology method)等。
5.1.1  半定量测定-凝胶法
凝胶法是各国药典细菌内毒素检查的首选方法。它是根据鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，终点判断采用翻转180º法。此法操作较简单、经济，不需要专用测定设备，可在0.03FU/ml的范围内进行半定量测定。其缺陷为特异性不强、精密度、定量性较差。
5.1.2  定量测定
随着鲎试验方法的测定仪器的不断完善，内毒素测定已向微量定量方向发展。定量测定在常规药品检查、生产过程质控、各种除热原方法的评价、特殊样品的检查(如血液、尿液、脑脊液)等方面，与凝胶法相比具有灵敏、快捷、准确的特点。据统计，当今美国鲎试剂的应用当中，超过50%的检查采用了定量方法。
5.1.2.1　浊度法(比浊法)
浊度法是利用分光光度计测定凝胶形成过程中伴随的浊度变化，从而定量测定细菌内毒素，可以分为终点比浊法和动态比浊法。通常在0.006-300EU/ml范围内进行定量测定。动态比浊法是美国官方认可的检查法，该方法已成为定量法的主流之一。此法操作简单速度快，灵敏度高，检测范围较宽，但需要精密的仪器。
5.1.2.2　显色基质法(比色法)　
显色基质法是利用凝固酶水解显色底物产生的显色基团使吸光度发生变化而进行定量测定的方法。可以分为终点比色法和动态比色法。
该方法灵敏度、精密度高，通常在0.006-300EU/ml范围内测定，但仪器和试剂昂贵，操作比较复杂。目前主要用于微量内毒素测定。目前，在国外细菌内毒素定量法的使用率大约占65%～70%，已经超过凝胶法，而且还呈上升趋势。
5.1.2.3　酶联免疫吸附测定法(ELISA)
    酶联免疫测定法(ELISA法)基于抗原抗体的酶联免疫测定法，目前在国外应用十分普遍。主要由外加热原质刺激巨嗜细胞后产生的内热原物IL-1等，而进行的定量测定方法。体外人全血热原检测方法是近年来国内外正在兴起的一种研究热原检测的新方法，具有检测范围广，灵敏度高，不同个体血液的结果差异小等优点[12]。国内一些学者，已采用酶联免疫测定法对体外人全血热原检测方法的可行性进行研究和优化，取得了可喜的进展[13]。
5.2  免疫学方法　
目前采用的方法主要有酶联免疫吸附检测法、火箭免疫电泳试验法、L-聚赖氨酸法、双抗体夹心法、荧光偏振法、125I气同位素标记法。这些方法的特点是特异性、准确性高，但其应用尚待大量临床实践的验证，操作尚待进一步简化。
5.3　生物学方法　
利用LPS刺激免疫细胞产生IL-1、TNF的特性，以标化的细胞系作为靶细胞，检测细胞培养上清中的IL-1、TNF等细胞因子含量，推算出待检样本中的LPS含量。
5.4  化学发光法　
应用CR1和CR3受体诱导中性粒细胞的氧化反应作为一个反应平台，通过测定内毒素对中性粒细胞的生物学作用来检测内毒素的含量。
5.5  流式细胞术　
应用针对内毒素表面抗原决定簇的单克隆抗体对内毒素进行荧光标定而后应用流式细胞仪进行检测。
 
6  内毒素的制备
内毒素的制备方法很多，各种方法所得的制品在纯度、活性、产量等方面均有所差异。方法主要有三氯醋酸法、酚水法、二乙二醇法、水乙醚法、水丁醇法、酚-氯仿-石油醚法等［14］。目前应用较多的是酚水法。
7  内毒素抗体的保护作用
内毒素具有较强的免疫原性，只需几十至数百微克即能明显诱导小鼠及家兔产生抗内毒素抗体。内毒素核心结构和类脂A在几乎所有革兰氏阴性菌之间具有明显的相似性和高度的稳定性，而且又是最具生物学活性和毒性的成份，因此用核心结构和类脂A统称为核心糖脂，CGL作为免疫原制备抗体，可获得具有广泛交叉反应性的保护性抗体，从而达到阻断几乎所有内毒素的病理生理作用。由CGL产生的抗体具有与几乎所有革兰氏阴性菌内毒素的结合能力。大多数科学家认为，这种结合能够阻断内毒素诱导靶细胞或组织释放炎症介质和细胞因子，起中和内毒素的毒性和促进网状内皮细胞系统吞噬清除的功能。临床研究表明，抗CGL血清或免疫球蛋白具有明显的防治革兰氏阴性菌感染性休克和减少死亡率的作用。但由于缺乏再次免疫应答，抗体滴度难以控制，导致抗体来源和标准化工作受到限制，此类抗体难以在临床上推广应用。近十年来，应用单克隆抗体技术制备的抗CGL抗体，克服了以上诸多缺点，临床上应用也是安全有效的，具广阔的发展前景。还有研究表明，内毒素抗体保护作用的大小与所使用的动物模型和感染的严重程度有关。在细菌生长初期，LPS的构建不完全，此时抗CGL抗体与核心结构结合，能显示出交叉抗感染的作用。如感染菌量过大，细菌还未充分繁殖，动物就死于细菌的直接毒性作用，此时抗CGL抗体也无法发挥中和LPS毒性的作用［15］。总之，内毒素抗体的研究为革兰氏阴性菌感染提供了免疫治疗的新途径，单抗的研制和开发具有潜在的临床实用价值，前景光明。
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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